摘要：目的以固相合成法合成穿膜肽TAT, 并对合成产物进行活性评价活性肽。方法采用Nа-芴甲氧羰基 (fluorenyl-methyloxyloxycarbonyl, FMOC) 作为α-氨基的保护基, 以逐个延伸的固相合成法合成穿膜肽TAT。应用高效液相色谱和质谱仪测定其纯度及相对分子质量;荧光显微镜观察穿膜肽TAT介导增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, pEGFP) 质粒在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果以评价穿膜肽TAT的生物活性;MTT法检测穿膜肽TAT与质粒DNA复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响。结果高效液相色谱和质谱鉴定所制备穿膜肽TAT的纯度为96.6%, 相对分子质量1880。它能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染, 并对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的穿膜肽TAT。
关键词： 固相多肽合成 穿膜肽TAT 活性研究
近年来, 国外学者在对一些病毒转染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域, 它具有介导大分子直接主动地穿过细胞膜进入细胞质和细胞核内的功能 [1-3 ] 活性肽。国内有学者将其译为蛋白转导域, 又称细胞穿膜肽 (cell-permeable peptides, CPP) 。CPP因具有惊人的携带大分子物质直接主动穿过细胞膜进入细胞质和细胞核内的功能及无细胞毒性而受到国内外学者的关注 [4, 5] , 目前研究最多的是人免疫缺陷病毒的转录活化因子 (transactivating transcriptional activator protein from human immunodeficiency virus type 1, HIV-1 TAT) , 这些发现为研制一种高效、安全的载体, 主动介导核酸跨越生物膜屏障进行基因治疗提供了广阔的前景。本研究采用Nа- 芴甲氧羰基 (fluorenylme thyloxyloxy carbonyl, FMOC) 固相肽合成法合成氨基端和羧基端均用半胱氨酸和甘氨酸修饰的穿膜肽TAT, 并对其进行体外活性评价。
1 方法
1.1 穿膜肽TAT合成步骤
1.1.1 树脂的溶胀
称取2 g Fmoc-Cys (Trt) -Wang 树脂, 加入NMP 20 ml, 溶胀树脂2 h活性肽。加入DCM 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 重复2次。加入20% PIPE 20 ml, 反应30 min后清空反应器, 重复1次, 加入DCM 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 再加入NMP 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 重复2次。
1.1.2 肽链的合成
往溶胀好的树脂中加1 g Fmoc-Gly-OH, 1 g HBTU用5 ml的NMP溶解, 加入3 mol/L的DIEA 40 μl, 混匀后加入反应器, 再加入15 ml的NMP反应2 h活性肽。清空反应器, 加入DCM 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 再加入NMP 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 重复2次。取样检测, 树脂黄, 溶液黄。加入20% PIPE 20 ml, 反应30 min后清空反应器, 重复1次, 加入DCM 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 再加入NMP 20 ml, 混匀1 min, 清空反应器, 重复2次。采用相同的操作步骤, 依次缩合Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr (But) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (Trt) -OH。
1.1.3 切肽
在最后形成的多肽树脂中, 加入切割液 (TFA) , 反应4 h, 用沙芯漏斗过滤, 收集滤液, 用冰乙醚离心沉淀, 冻干, 称质量计算产率活性肽。
1.2 高效液相色谱分离和质谱测定
用 Waters 高效液相色谱仪进行粗肽的分离活性肽。用C18柱, 检测波长210 nm [6] 。洗脱液 A:0.05% TFA+2% ACN;B: 0.05% TFA+90% ACN。线性梯度由0%～30% B溶液, 时间30 min, 流速1.0 ml/min。对收集的主峰, 进行质谱测定。
1.3 体外活性测定
1.3.1 质粒的抽提
将pEGFP转化DH5α大肠杆菌, 卡那霉素筛选后挑选单克隆扩增, 参照质粒抽提试剂盒说明书抽提纯化质粒活性肽。取少量质粒进行琼脂糖凝胶电泳, 紫外分光法测定吸光度值, 调整质粒浓度至0.1 μg/μl。
1.3.2 转染复合物的制备
首先将穿膜肽TAT与1 μg质粒DNA以8∶1的电荷比分别用5 μl的0.15 mol/L NaCl稀释, 再将稀释后的质粒DNA溶液滴入TAT肽溶液中, 通过剧烈吹打使二者混匀, 复合物室温孵育30 min后, 最后加入250 μl无血清、无双抗的DMEM活性肽。电荷比的计算是基于DNA每330带一个负电荷, TAT肽每247带一个正电荷 [7] 。
1.3.3 实验分组
A组:空白对照组;B组:单纯质粒DNA转染组;C组:TAT转染组 (DNA+TAT) ;每组均有3个样品活性肽。
1.3.4 细胞培养与穿膜肽TAT的活性测定
人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) 在含10%FBS和1%双抗的DMEM培养液中于37℃、5%CO2培养箱条件下培养, 取对数生长期细胞以每孔0.5×105的密度接种在24孔培养板, 24 h后细胞达到60%～70%汇合时进行穿膜肽TAT的活性测定活性肽。测定前, 吸弃培养板中的旧培养液, 用PBS冲洗2次, 再将含有1 μg质粒DNA的TAT复合物加入每孔。放入37 ℃、5%CO2培养箱孵育4 h后, 吸弃复合物, 加入完全培养基。孵育24 h后, 使用倒置荧光显微镜观察EGFP在HUVEC中的表达情况。所有实验重复3次。
1.3.5 细胞活性分析
HUVEC细胞按每孔细胞数为1×104接种96孔板中, 培养过夜, 吸弃培养基, 每孔中加入不含血清及抗生素的培养基200 μl, 再分别加入不同电荷比的样品各5 μl, 每一样品3复孔, 于37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养24 h活性肽。于24 h后取出细胞, 每孔加入MTT 20 μl (5 mg/ml) , 37 ℃ 继续孵育4 h, 终止培养, 小心吸弃孔内培养上清液, 每孔加入DMSO 150 μl, 振荡10 min, 使紫蓝色结晶能够完全溶解。在酶标仪上以490 nm波长检测各孔的吸光度值[D (490) ], 计算细胞活性。细胞活性=D (490) 试验组/D (490) 对照组×100%。
1.4 统计学分析
采用SPSS 14.0统计分析软件进行分析, 计量资料以表示, 多组之间比较采用方差分析活性肽。
2 结果
2.1 高效液相色谱鉴定纯度
从穿膜肽TAT的色谱分析结果可以看出, 主峰面积较大, 其他峰面积与主峰相比较小 (图1) , 表明合成的TAT杂质少, 纯度高活性肽。根据HPLC色谱图中峰面积计算, 纯度达到96.6%。
2.2 质谱鉴定
MALDI-TOF-MS分析的结果显示, 实际合成的TAT相对分子质量为1 880.01, 与TAT的理论分子质量1 880.24相差无几活性肽。同时也可以看出, 图中主峰明显, 说明本次合成的MSH经色谱仪纯化后, 可以除去大部分的杂质, 从而得到较纯的TAT (图2) 。
2.3 荧光显微镜观察穿膜肽TAT的体外活性
转染24 h后, 荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达见图3活性肽。A、B组均没有观察到绿色荧光, C组可观察到绿色荧光, 表明本实验所合成的穿膜肽TAT具有一定的穿膜特性, 可以携带pEGFP穿过细胞膜进行基因转染。
图3 TAT携带pEGFP在体外培养人脐静脉内皮细胞中 的基因表达情况的基因表达情况 (荧光显微镜×400)
2.4 细胞活性
A、B、C组的吸光度值分别为 (0.800±0.005) 、 (0.792±0.003) 、 (0.792±0.012) , B、C组与A组比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 表明质粒DNA与穿膜肽TAT的复合物对细胞活性没有明显的影响活性肽。
3 讨论
本研究采用Fmoc固相方法合成穿膜肽TAT, 粗肽经过纯化和分析得到预期活性产物活性肽。合成中, 选用Fmoc-Cys (Trt) -Wang 树脂为合成起点, 将TAT的羧端固定在树脂上, 向氨基端逐步递加、延长肽链, 每一步反应较易进行, 消旋化的可能性小, 但要求每步反应都应达到高产率。目标肽的粗品经高效液相色谱及质谱分析后, 纯度为96.6%, 其相对分子质量与理论值相等。由于多肽是用固相法合成, 氨基酸的连接顺序固定, 证明了合成TAT结构的正确。
Siprashvili等 [8] 的研究表明, 11个氨基酸的TAT肽不促进基因转染, 而在富含精氨酸TAT肽的核心序列的氨基端和羧基端加上半胱氨酸, 能够促进基因转染活性肽。这可能是由半胱氨酸的可逆氧化交联引起的, 从而能使质粒DNA与穿膜肽TAT复合物稳定。并且在TAT肽核心序列的氨基端和羧基端均加半胱氨酸和甘氨酸, 可进一步促进基因转染。本实验所合成的穿膜肽TAT的相对分子质量为1 880, 序列为:CGYGR KKRRQ RRRGC。生物活性测定表明:TAT肽具有良好的穿膜性, 能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染, 并对细胞活性无明显影响, 提出了用半胱氨酸和甘氨酸修饰后的穿膜肽TAT用于基因转染的潜在应用价值。它可以作为有效的非病毒基因转染载体, 为今后治疗基因的转染提供了实验依据。
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