摘要 用液相合成方法合成了具有镇痛作用的μ阿片受体的内源性配体——内吗啡肽-1(endomorphin-1),该四肽为Tyr-Pro-Trp-PheNH₂.液相合成法是在氨基酸的N端用Boc(叔丁氧羰酰基)作保护基活性肽，C端用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)活化，与未加保护基的氨基酸在碱性条件下接肽·先分别合成C端二肽和N端二肽，再缩合为四肽，产物的保护基用盐酸脱帽去除.中间产物用薄层层析和熔点鉴定其纯度，最终得到了高纯度的四肽·小白鼠脑室注射(icv)测定表明，8.25nmol剂量给药，其镇痛活性为87%,明显高于吗啡(morphine).
关键词 内吗啡肽-1,μ阿片受体活性肽，镇痛，液相合成
内吗啡肽-1(endomorphin-1)是Zadina等于1997年发现的一种具有镇痛作用的四肽.它存在于哺乳动物脑内活性肽，是内源性的μ阿片受体的激动剂.它对μ阿片受体有高亲和性和选择性，内吗啡肽-1是当今所知对μ阿片受体亲和力和选择性最高的生物活性肽由于吗啡在体内作用于μ阿片受体，因此这个内源性多肽的发现具有重要的意义.该四肽具有很强的镇痛作用，且其体外活性远远超过μ受体选择性激动剂——DAM GO(Tyr-d-Ala-Gly-N-Me-Phe-Gly-o1),成为发现脑啡肽(enkaphalins)、β内啡肽(βendorphin)和强啡肽(dynorphin)后的又一种内源性阿片肽.
活性肽我们采用液相合成法合成了内吗啡肽-1,并研究其镇痛活性·
1 方法
1.1 硅胶薄层层析
使用两种层析系统S₁和S₂.S₁:醋酸丁酯：异丙醇为10:4,吡啶：醋酸：水为4:1:1,前者七份与后者三份相混.S₂:正丁醇：醋酸：水为4:1:1.显色剂为茚三酮或氯气显色剂.
1.2 合成方法
Fig 1为合成路线活性肽，其中化合物I到IV是合成四肽的中间产物，合成方法是氨基酸(或二肽)的N端用Boc基保护，C端用OSu基活化.化合物Ⅲ的Boc基用常规的50%TFA法去除，产物V的Boc基用2.5molL的HCI/乙酸乙酯溶液去除.
Boc-Tyr-Pro-OH(I):BocTyrOSu 0.85g(3.3mmol)和0.34g(35mmol)L-Pro在四氢呋喃与KHCO₃水溶液中30℃反应2d得到0.644 g(1.88mmol)白色固体活性肽，产率57%,m.p.111℃～113℃,薄板层析纯，Rғ(S₂)=0.79.
Boc-Tyr-Pro-OSu(Ⅱ):0.644g(1.88mmol)化合物I溶于四氢呋喃中活性肽，加入216mg(1.88mmol)HOSu,冰溶中滴加383mgDCCI(1.88mmol),冰浴反应6h后，滤除DCU,抽去四氢呋喃，得Boc-Tyr-Pro-OSu 0.642 g(1.35mmol).产率71.8%,m.p.48℃～50℃,薄板层析纯，Rғ(S₁)=0.87.
Boc-Trp-PheNH₂(Ⅲ):Boc-Trp-OSu 10g(2.49mmol)与0.50 g(30mmol)Phe-NH₂溶于四氢呋喃与KHCO₃水溶液中30℃反应2d,得到1.0g(2.22mmol)化合物Ⅲ.产率89.1%,m.p.177℃～179℃,薄板层析纯活性肽，Rғ(S₁)=0.85·
TFA-Trp-PheNH₂(IV):1.0 g化合物Ⅲ(2.21mmol)在50%TFA/CH₂Cl₂溶液中(含5%苯甲醚活性肽，5%巯基乙醇),28℃水浴反应1h.抽去CH₂Cl₂,加入甲醇2次，分别抽干，用无水乙醚研磨，P₂O₅真空干燥，得0.681g(1.47mmol)产品·产率66%,m.p.168℃~169℃,薄板层析纯，Rғ(S₁)=0.73·
Boc-Tyr-Pro-Trp-PheNH₂(V):化合物IV0.681 g(1.47 mmol)与化合物Ⅱ 0.642 g(1.35mmol)溶解于四氢呋喃与KHCO₃水溶液中活性肽，30℃反应2d,缩合得0.796g化合物V(1.12mmol).产率83%,m.p.127°℃~129℃,薄板层析纯，Rғ(S₁)=0.86·
Tyr-pro-Trp-PheNH₂(VI):化合物(V)35mg溶于200μl无水乙酸乙酯，加入50μl12.5mol/L的HCI/乙酸乙酯溶液，冰浴反应2.5 h,倾掉液体，将固体干燥，得土黄色固体20mg·产物用3ml双蒸水溶解，然后在C18反相高效液相色谱柱上进行分离纯化，使用25%乙腈(内含0.1%TFA)为流动相等梯度洗脱.收集四肽峰，冷冻干燥后得到产品11mg.薄板层析纯，Rғ(S₁)=0.58活性肽。
1.3 小白鼠光辐射热甩尾法测定镇痛活性
选用昆明小白鼠(雄雌各半),体重18~20 g,固定于支架上活性肽，尾部暴露于外.试验前先用75%乙醇擦净鼠尾，墨汁涂于尾部的下1/3处作为光刺激点的标志，固定调节好辐射热测痛仪的焦距，并在聚集的鼠台档板上作一标记.
测痛时，使鼠尾的光刺激点标记与档板上标记对应重合，使测痛的鼠尾部位针对透镜焦点，待小鼠安静后进行致痛实验.实验时，用秒表计时，从照射开始到甩尾的时间作为痛阈.调节负载电压到20 V左右，选用2～4s引起甩尾反应的热刺激强度.实验开始时先测3次，每次间隔5min,取平均值作为基础甩尾阈.给药后每隔10min测定一次，1h后则每隔30min测一次，共测定60~90min.给药途径为脑室注射(icv).每次试验设对照组(生理盐水及吗啡)作平行观察.为防止皮肤烫伤，光辐照时间为10 s,将结果按下述公式计算出最大效果百分率，用以评定药物的镇痛强度活性肽。
镇痛计算公式：镇痛效应百分率=(给药后甩尾阈-基础甩尾阈)/基础甩尾阈×100%
2 结果
2.1 内吗啡肽-1的纯度鉴定
内吗啡肽-1的HPLC鉴定活性肽，为一个单峰(Fig2).
2.2 内吗啡肽-1镇痛活性测定
与吗啡作比较，脑室注射(icv)8.25 nmol(5μg)内吗啡肽-1后30min,其镇痛活性达87%(Fig.3),明显高于 13.2nmol(5μg) 吗啡的活性活性肽。
3 结语
由于内吗啡肽-1是近年来发现的具有强烈镇痛活性的多肽，我们实验室合成了高纯度的内吗啡肽-1,其镇痛活性明显高于吗啡.如果它能通过血脑屏障，将带来很大的临床应用价值.1993年Wang JX曾用聚乙烯大头针技术(polyethylene pintechnology)合成内吗啡肽-1及其类似物，并研究了它们的镇痛活性，但合成的量有限活性肽。由于内吗啡肽-1仅含4个氨基酸，我们采用液相合成法方便快速，纯度高，而且可大量合成。在合成过程中，我们用Boc作氨基酸N端的保护基，C端用HOSu活化，在碱性条件下与另一氨基酸形成二肽。脯氨酸(L-Pro)的N端为亚氨基，一般接肽效率比较低，但由于我们采用了活化酯的方法，仍得到了较好的产率最后在Boc四肽(Boc-Tyr-Pro-Trp-PheNH₂)脱帽时，液相合肽一般用50%TFA,我们曾用50%TFA脱帽，生成四肽的TFA盐，然后再除去N端的TFA,所得产物溶解度较低，且不易纯化。后来我们改用HCI/乙酸乙酯法脱Boc四肽的Boc基，得四肽的盐酸盐，溶解度明显改善且容易分离纯化，最后经HPLC鉴定为一单峰，得到了高纯度的内吗啡肽-1。
我们还在内吗啡肽-1的N端用乙酰化、糖基化进行修饰，分别合成乙酰化内吗啡肽-1、葡萄糖-1-脱氧果糖化内吗啡肽-1及1-脱氧果糖内吗啡肽-1活性肽。糖基化反应的机理是阿马道里重排,但这三种四肽衍生物均没有镇痛活性，这说明内吗啡肽-1的N端的结构对镇痛活性非常重要。
今后我们将进一步研究内吗啡肽-1是否能通过血脑屏障，是否有耐药性，并将对内吗啡肽-1作进一步的改造或修饰以提高镇痛活性或延长在体内的半衰期活性肽。
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